CellSigFlow : 基于流的细胞间通信优化框架

背景

细胞间通讯（CCC）对于组织构建、发育程序和疾病进展至关重要。单细胞和空间转录组学的兴起使得以前所未有的分辨率推断配体-受体（L-R）相互作用成为可能，许多计算框架被提出，旨在整合基因表达与空间信息以预测潜在的信号传导事件。 诸如 CellPhoneDB 和 CellChat 等早期方法主要在细胞簇（cluster）水平上推断 L-R 相互作用。虽然这些方法捕捉到了全局信号模式，但它们无法解析单细胞水平的通讯。此外，它们通常孤立地分析每一对 L-R 配对，这限制了其揭示涉及多种配体和受体协同作用的真实信号网络复杂性的能力。 针对空间转录组学设计的近期工具（包括 Giotto、NICHES 和 COMMOT）结合了邻域信息或最优传输（optimal transport）来实现细胞级预测。尽管取得了这些进展，但仍存在重要的局限性。现有方法通常忽视细胞内受体和配体之间的竞争，并且很少对由配体或受体丰度施加的容量限制（capacity constraints）进行建模。因此，预测的通讯连边可能缺乏生物学真实性，表现为虚假的信号缺失或不切实际的信号饱和。此外，大多数框架仍局限于单步 L-R 配对，大部分未探索多步中继级联。

为了解决这些挑战，我们提出了一种名为 CellSigFlow的方法，该方法将 CCC 建模为一个有界的最小费用流问题（bounded minimum-cost flow problem）。

在该框架中，每个细胞被表示为一个节点，构建以受体为中心的有向边，并将通讯强度建模为边流量（edge flow）。空间距离和分子亲和力被纳入代价函数中，以惩罚长距离相互作用并倾向于生物学上合理的结合。通过引入与受体丰度成正比的上界和基于先验知识的下界，该模型确保了非零但受生物学限制的流量。这种设计使得该框架能够捕捉细胞内多个受体争夺同一配体的竞争，在单细胞水平解析信号，并自然地整合多个 L-R 对，以重建超越孤立相互作用的复杂通讯网络。

方法详解

我们将空间细胞通讯视为一个带有上下界约束的最小费用可行流问题。

建图

我们将每个细胞视为一个图中的节点。假设 $A$ 为配体细胞（源细胞），$B$ 为受体细胞（目标细胞），当且仅当 $A$ 和 $B$ 的配受体亲和度达到阈值，且两者空间距离在一定的范围内时，我们才建立一条 $A\to B$ 的有向边（生物先验约束）。

注意，细胞 $A$ 可能有很多的配体会与细胞 $B$ 的某个受体结合。为了减少计算复杂度，这里我们先把它们合并，建立一条受体中心的边，计算完网络流后再进行拆分。

对于目标细胞 $j$，以及在 $j$ 中表达的每个受体 $R$，如果源细胞 $i$ 与其空间距离 $d_{ij}$ 低于截断值 $D$，并且在 $i$ 中存在至少一个能与 $j$ 中的 $R$ 结合的配体 $L$，我们就建立一条从源细胞 $i$ 指向目标细胞 $j$ 的有向边 $(i,j,R)$。因此，一对细胞之间可能通过多条边连接，其边的数量取决于目标细胞上不同受体的数量；通讯强度被建模为边 $(i,j,R)$ 上的流量 $f_{ij}^{(R)}$。

网络流所得到的边的流量表示配受体对之间的通讯强度，现在定义流量需满足上下界约束：

对于每一条以受体为中心的边，其流量受到下界 $L_{ij}^{(R)}$ 和上界 $U_{ij}^{(R)}$ 的约束：

$$L_{ij}^{(R)}\le f_{ij}^{(R)}\le U_{ij}^{(R)}$$

这里上界为受体基因的表达值，约束通讯强度不可能超过细胞受体的接受能力。

下界则约束某对配受体通路至少有一定的通讯强度，一般由先验知识引入，比如基于其他粗粒化的细胞配受体通讯分数比 $\times$ 上界缩放而得，大部分配受体对的下界可以设为 0。

在满足上下界约束，以及网络流基本约束条件的同时，我们寻找一种最小化总费用的方案。

这里定义单位费用与距离（思想类似 COMMOT）以及亲和度总和相关，总费用为每条边的流量 $\times$ 单位费用之和。你可以将这种机制视为对违反动力学约束的一种惩罚。

有界最小费用流的公式化表述要求系统除了满足容量的上下界约束外，还需遵守每个节点的流量守恒，并最小化总传输费用。边 $(i,j,R)$ 上针对特定受体的费用定义为：

$$c_{ij}^{(R)}={\lambda }_d{d}_{ij}+{\lambda }_a\psi ({\mathrm{affinity}}_{ij}^{(R)})$$

其中 $d_{ij}$ 表示细胞间的空间距离，$\psi (\cdot )$ 编码了一个以受体为中心的亲和力项，它聚合了 $i$ 中所有能够结合 $j$ 中受体 $R$ 的配体的贡献。优化目标是最小化总费用：

$$\underset{f}{min}\sum _{(i,j,R)}{c}_{ij}^{(R)}{f}_{ij}^{(R)}$$

综上则有：

$$\{\begin{array}{l}{L}_{ij}^{(R)}\le f_{ij}^{(R)}\le U_{ij}^{(R)},\\ {\displaystyle \sum _{(u,R)}{f}_{ui}^{(R)}-\sum _{(v,R)}{f}_{iv}^{(R)}=0,\mathrm{\forall }i,}\end{array}$$

优化方法

可行性优化

不难注意到，因为上下界限制，网络流很容易没有可行解，导致无法计算通讯强度。所以我们应该允许细胞适当地不满足流量守恒：

$$\{\begin{array}{l}{L}_{ij}^{(R)}\le f_{ij}^{(R)}\le U_{ij}^{(R)},\\ {\displaystyle \sum _{(u,R)}{f}_{ui}^{(R)}-\sum _{(v,R)}{f}_{iv}^{(R)}=b_i,\mathrm{\forall }i,}\end{array}$$

所以我们可以引入虚拟源汇点，并建立虚拟边连接每一个细胞，边 cost 设为无穷大，这样可以有效最小化虚拟节点对于可行解的破坏。

如此，在这种情况下求解带有上下界约束的最小费用可行流就不会出现无法计算的意外情况。

非线性捕捉

注意到上述 cost 是呈线性变化的，即通讯强度增加而 cost 也线性增加。

我们可以引入分段线性来捕获凸函数关系。

上面的目标是线性的：每条边费用为 $c_{ij}^{(R)}{f}_{ij}^{(R)}$。

然而在实际情况要复杂得多，很多时候其实两者之间的关系多为凸函数：少量信号传递很有效，而当同一配受体通路被大量占用时，会出现受体饱和、配体竞争、局部扩散等效应，使得新增通讯的边际代价递增。

因此可以令每条边的费用为凸函数：

$$\underset{f}{min}\sum _{(i,j,R)}{\varphi }_{ij}^{(R)}\left(f_{ij}^{(R)}\right)$$

为保持最小费用流的可解性，对区间 $[0,U_{ij}^{(R)}]$ 取断点：

$$0=q_0<q_1<\cdots <q_K=U_{ij}^{(R)},$$

第 $k$ 段长度 ${\mathrm{\Delta }}_k=q_k-q_{k-1}$，边际单位费用为：

$$c_k=\frac{\varphi (q_k)-\varphi (q_{k-1})}{q_k-q_{k-1}}$$

把原边 $(i,j,R)$ 替换成 $K$ 条平行边 $(i,j,R,k)$：

• 容量：${\mathrm{\Delta }}_k$
• 单位费用：$c_k$

并令：

$$f_{ij}^{(R)}=\sum _{k=1}^K{f}_{ij}^{(R,k)},0\le f_{ij}^{(R,k)}\le {\mathrm{\Delta }}_k.$$

求解

为了快速完成求解，我们将其转化为一个传统的最小费用最大流（MCMF）问题。

我们定义残余流量变量：

$$f_{ij}^{\prime (R)}=f_{ij}^{(R)}-L_{ij}^{(R)},0\le f_{ij}^{\prime (R)}\le U_{ij}^{(R)}-L_{ij}^{(R)},$$

并利用调整后的节点平衡量 $b_i^{\prime }$ 和新增的 $S$-$T$ 边，在这个残余网络上求解一个最小费用最大流问题。优化目标为寻找：

$$\underset{f^{\prime }}{min}\sum _{(i,j,R)}{c}_{ij}^{(R)}{f}_{ij}^{\prime (R)},$$

需满足残余容量和流量守恒约束。如果在最优解中所有 $S$-$T$ 边都饱和，则该有界流问题是可行的；否则，在给定的上下界下不存在可行流。原始流量通过以下方式恢复：

$$f_{ij}^{(R)}=f_{ij}^{\prime (R)}+L_{ij}^{(R)},$$

且最小总费用分解为：

$${\mathrm{Cost}}^{\ast }=\sum _{(i,j,R)}{c}_{ij}^{(R)}{L}_{ij}^{(R)}+\sum _{(i,j,R)}{c}_{ij}^{(R)}{f}_{ij}^{\prime (R)\ast }.$$

在计算出以受体为中心的边流量 $f_{ij}^{(R)}$ 后，CellSigFlow 进一步将信号分辨率精细化到单个 L-R 对的水平。对于目标细胞 $j$ 中的每个受体 $R$，来自源细胞 $i$ 的总入流量 $f_{ij}^{(R)}$ 会在 $i$ 中表达且能与 $R$ 结合的所有配体 $L$ 之间进行重分配。重分配的权重由配体-受体亲和力和配体表达水平决定：

$$f_{ij}^{(L,R)}=\frac{{\omega }_{ij}^{(L,R)}}{\sum _{L^{\prime }}{\omega }_{ij}^{(L^{\prime },R)}}{f}_{ij}^{(R)},{\omega }_{ij}^{(L,R)}=\psi ({\mathrm{affinity}}_{ij}^{(L,R)})\cdot {\mathrm{expr}}_i(L)$$

其中 ${\mathrm{expr}}_i(L)$ 表示细胞 $i$ 中配体 $L$ 的表达量，$\psi (\cdot )$ 是基于亲和力的加权函数。这种分层重分配产生了解释性强的“单配体-单受体”信号流，同时保留了有界流模型的全局优化结构。

实验结果

基于 PDE 模拟的基准测试

由于配体-受体共定位数据的稀缺，直接验证 CCC（细胞间通讯）推断方法受到限制。为了建立受控的基准，受 COMMOT 模拟工作的启发，我们构建了一系列基于偏微分方程（PDE）的反应-扩散模型，模拟配体的扩散、产生、降解以及受体结合动力学，从而捕捉细胞间信号传导的关键生物物理过程。 我们设计了三种代表性的场景（regimes）：类型 1，多种配体竞争少量受体；类型 2，多种受体竞争少量配体；以及类型 3，复杂的相互连接的配体-受体网络。通过改变配体和受体的数量及其连接性，我们生成了涵盖这些场景的合成网络。 我们使用多种评估指标，将 CellSigFlow 与 CellChat 和 COMMOT 进行了基准对比。在所有场景中，CellSigFlow 与基准真值（ground-truth）通讯场的一致性最高，优于其他两种方法。这些基于 PDE 的模拟表明，CellSigFlow 能更忠实地将细胞间信号传导捕捉为连续的空间流（spatial flows)。

平均Spearman相关性总结如下

在所有机制中，CellSigFlow 与地面真实通信场取得了最高的一致性，优于两种替代方案。这些基于 PDE 的模拟表明，CellSigFlow 更真实地将细胞间信号捕获为连续空间流。

以（类型一：多种配体竞争少量受体）为例

配受体竞争关系如下 L1,L2,L3 为配体；R1,R2,R3,R4,R5为受体。每个配体分别与所有受体都存在结合关系。

从与 PDE 生成的GT对比结果来看，CellSigFlow 与真实值的线性一致性最高：在散点图中其点云最贴近对角线（y=x），整体偏差更小，说明它能在不同强度区间都较稳定地复原 PDE 的通信强度；相比之下，CellChat 的散点分布更分散、系统性低估/偏离更明显，COMMOT虽能捕捉到一定趋势，但仍存在更明显的偏移与离散度。

与2D物理模型（log1p变换）的比较

这一结论在二维空间热图中更直观：Original PDE 显示出多个高值团块及其向外平滑衰减的结构；CellSigFlow 基本复现了这些热点的位置、形状与“连续扩散”的背景梯度（整体形态最接近 PDE），表明它更像是在学习“连续空间流”的信号传播；CellChat 则表现为大面积接近零、仅在局部角落或近邻区域有响应，容易丢失竞争条件下的远距/叠加效应；COMMOT 能生成较强的空间结构，但在热点形态、扩散范围或背景分布上仍与 PDE 存在可见差异, 特别是白色框内的热点捕获差异显著。

针对复合物的可视化

小鼠嗅球数据分析

(A) 按总流量排名的前 15 个配体-受体对。深色条突出显示与已知神经-胶质和生长因子通路一致的主导信号传导。(B) 中继路径平均流量值的分布。0.2 附近的单一峰值反映了相邻细胞簇之间连贯且一致的两步信号传播。

我们将 CellSigFlow 应用于小鼠嗅球的 10x Genomics Visium 空间转录组数据，在 1,185 个空间斑点（spots）之间生成了一个包含 191,498 条有向边的连通通讯网络。该分析揭示了 591 个配体-受体对和 500 条两步中继路径（relay paths），描绘了整个组织中连贯的信号层级。其中，Psap-Gpr37l1 信号轴显示出最高的累积流量（216.5），这与支持神经元存活和胶质细胞稳态的“星形胶质细胞-神经元”营养信号传导相一致。Ptn-Ptprz1、Ptn-Ncl 和 Ptn-Sdc3 形成了一个促进神经突生长和突触可塑性的多效生长因子（PTN）模块，而 Ncam1-Ncam1 则反映了对轴突导向和突触稳定至关重要的同嗜性粘附。Fgfr1-Fgfr1 和 Sdc4-Fgfr1 等中等流量的信号轴表明成纤维细胞生长因子（FGF）信号参与了结构维持。中继路径分析显示平均流量相对一致（0.17-0.24），表明信号传播是协同的而非随机的。值得注意的是，诸如Ptn→Ptprz1→Cadm3/Nectin1→Cadm3 和 Psap→Gpr37l1→Nlgn3/Cadm3 的级联路径将生长因子信号与粘附信号联系起来，反映了突触成熟的机制。综上所述，这些发现表明，CellSigFlow 能够捕捉空间组织背景下，构成神经-胶质细胞相互作用及突触组织基础的直接和多步通讯事件。

总结

在本研究中，我们介绍了 CellSigFlow，这是一种新颖的框架，将细胞间通讯（CCC）建模为有界的最小费用流问题（bounded minimum-cost flow problem）。通过对受体水平的约束、配体可用性和空间背景进行显式建模，CellSigFlow 提供了细胞间信号传导的具有生物学基础的表征。与早期的簇水平或成对分析方法不同，CellSigFlow 解析了配体和受体之间的竞争，对信号通量施加了现实的上下界，并捕捉了多步中继（multistep relay）相互作用，从而对细胞通讯网络提供了更丰富、更忠实的刻画。通过基于 PDE 的模拟，我们证明 CellSigFlow 优于 CellChat 和 COMMOT 等现有成熟方法，与基准真值（ground-truth）通讯场始终保持更高的一致性。这证实了我们基于流的建模在捕捉信号过程的动态和竞争本质方面的效用。在小鼠嗅球中的应用证实，受 Psap-Gpr37l1 和 Ptn-Ptprz1 等关键信号轴的驱动，CellSigFlow 能够捕捉符合生物学逻辑的神经元-胶质细胞及突触信号传导。综上所述，这些发现凸显了 CellSigFlow 是单细胞和空间转录组学分析的一种稳健且可扩展的工具。通过将空间距离、分子亲和力以及受体-配体约束整合到一个统一的优化问题中，CellSigFlow 弥合了理论建模与真实生物系统之间的差距。展望未来，该方法为系统解析跨组织和疾病的复杂信号景观铺平了道路，具有揭示新的治疗见解并指导后续实验验证的潜力。

作者：Menghan Wang, Junya Yang, Jiaxing Chen
单位：Guangdong Provincial/Zhuhai Key Laboratory IRADS, Beijing Normal–Hong Kong Baptist University
链接： https://academic.oup.com/bib/article/26/Supplement_1/i15/8378018